LABORATORIO DE FISIOLOGÍA ANIMAL, ASOCIACIONES SIMBIÓTICAS Y SALUD AMBIENTAL Y HUMANA

Nuestro multidisciplinario grupo de trabajo está comprometido con el desarrollo de la investigación básica y aplicada, la educación universitaria, la extensión a la comunidad, y la gestión institucional.

Las tareas de Investigación Básica están orientadas a dar respuesta a diferentes hipótesis en los campos de la fisiología animal y la fisiología comparada, así como contribuir en áreas más aplicadas de la salud ambiental y la salud humana. Por un lado, estudiamos una familia de gasterópodos acuáticos, que reúnen un conjunto de características biológicas y ecológicas que han permitido postularlo como modelo para estudios de evolución, simbiogénesis, toxicología ambiental, parasitología e inmunología. Los problemas de investigación de nuestras líneas de trabajo incluyen respuestas moleculares, celulares y tisulares en marcos espacio-temporales específicos. Con la secuenciación del genoma de la especie modelo [Pomacea canaliculata], hemos comenzado a explorar diferentes fenómenos fisiológicos mediante estudios de proteómica y transcriptómica.

Por otro lado, estamos desarrollando un proyecto de Epidemiología Basado en Aguas Residuales a través de los cuales pretendemos contribuir a conocer la dinámica de circulación viral (SARS-CoV-2 y virus de la hepatitis A) y de transferencia de genes de resistencia a antibióticos entre enterobacterias. Desde un enfoque “One Health” pretendemos describir el microbioma de las aguas residuales tratadas del gran Mendoza, que se utilizan en su gran mayoría para riego de cultivos. Hemos conformado equipos interinstitucionales junto a la empresa Aguas Mendocinas, el Departamento de Irrigación de Mendoza, el INTA sede Mendoza, y el Ministerio de Salud de la provincia de Mendoza. Asimismo, se realizan colaboraciones con grupos de investigación de las provincias de Córdoba, Salta y Buenos Aires, con objetivos específicos similares.

Las tareas universitarias se desarrollan a nivel de grado y posgrado en las Facultades de Ciencias Exactas y Naturales y Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo, específicamente en los espacios curriculares como Evolución y Desarrollo, Histología, Fisiología, Epistemología, Metodología de la Investigación, y Estadística. Nuestro grupo participa en propuestas de cursos y tares de gestión en tres doctorados de UNCuyo: en Ciencia y Tecnología (FCEN-UNCuyo), en Medicina (FCM-UNCuyo) y en el Programa de Postgrado en Biología (PROBIOL-UNCuyo).

Líneas de Investigación

I. Hasta que la evolución nos separe: la diversidad de asociaciones simbióticas en los ampuláridos

El objetivo general de esta línea de trabajo es estudiar el ‘hologenoma’ de Pomacea canaliculata para identificar microorganismos simbióticos que cumplen un rol sustantivo en la evolución de estos gasterópodos. La composición y diversidad de los simbiontes bacterianos alojados en el intestino de estos gasterópodos acuáticos aún no es bien comprendida y desconocemos los factores ambientales y características inmunológicas del huésped que determinan la estructura definitiva en animales adultos, pero los datos preliminares soportan varias funciones digestivas del huésped.

Identidad, filogenia, y transmisión de un simbionte intracelular

La glándula digestiva de Pomacea canaliculata aloja un microorganismo simbiótico (Fig.1) que es reconocido in situ utilizando sondas fluorescentes dirigidas a regiones conservadas de bacterias y cianobacterias en el gen que codifica el RNA ribosomal 16S. El análisis filogenético de este marcador sugiere que el simbionte pertenece a un grupo hermano de los cloroplastos de plantas y las cianobacterias. Este simbionte está siempre presentes en la glándula digestiva de los adultos, y su ciclo de vida se completa entre el estómago y el intestino del animal. Curiosamente, el simbionte aparece tempranamente en la ontogenia del animal (7 días luego de la eclosión), y habría una transmisión “vertical” o “materna”. Esta característica ofrece la oportunidad única de estudiar desde una perspectiva Evo-Devo la colonización del simbionte en una ventana específica de tiempo y conocer cómo se determina el fenotipo fisiológico funcional de la glándula digestiva. Asimismo, nuestro laboratorio busca comprender cómo este animal logra distinguir entre bacterias ambientales que acepta como propias y aquellas que no lo son. Para ello, se utilizan dos enfoques paralelos: (1) la construcción de una biblioteca de clones bacterianos utilizando el gen que codifica el RNA ribosomal 16S (Fig.2), y, (2) la construcción de una biblioteca (meta)genómica a partir de muestras de DNA del huésped, del simbionte intracelular y de la comunidad simbiótica asociada al sistema digestivo.

Distribución de la simbiosis en la filogenia del huésped

Características morfológica-genético-moleculares del simbionte intracelular de la glándula digestiva han consolidado la idea de su naturaleza procariota, así como también la posibilidad de un evento único y antiguo de asociación simbiótica en un ancestro de los gasterópodos de la familia Ampullariidae. Esta hipótesis está siendo explorada en especies representativas de los diferentes clados de la familia de los huéspedes ampuláridos (Fig.3).

II. Fisiología digestiva de Pomacea canaliculata: “plasticidad enzimática en escenarios digestivos específicos”

La naturaleza invasiva de Pomacea canaliculata en ecosistemas naturales y artificiales se ha relacionado con diversas características de su biología. Estas características incluyen su resistencia a factores ambientales, su capacidad para regenerar tejidos en individuos adultos y reproducirse en diversas situaciones ecológicas. Además, tienen la capacidad de consumir diversos recursos tróficos, especialmente cuando faltan macrófitas. El objetivo de esta línea de investigación es comprender la fisiología digestiva de Pomacea canaliculata, las cual está enfocada en su plasticidad enzimática, su variada dieta y mecanismos alternativos de alimentación. El sistema digestivo de este caracol polífago consta de varias partes: (a) la cavidad bucal que recibe las aberturas de un par de glándulas salivales, (b) el esófago con un par de glándulas ventrolaterales y un buche expandido en su porción medial que retiene los alimentos durante la digestión, (c) un estómago de tres cámaras, que comprende una molleja musculosa, un vestíbulo que recibe la aberturas de la glándula digestiva y el saco del estilo, (d) un intestino delgado, (e) un intestino contoneado y (f) el recto con una glándula anal. A través de estudios bioquímicos y proteómicos hemos descubierto una gran diversidad de glicosidasas, particualrmente celulasas y hemicelulasas (Fig.4) en el esófago medio y el saco del estilo, que permiten la digestión de biopolímeros glucídicos complejos presentes en algas y paredes celulares de las plantas que comen. Esta diversidad enzimática parece estar relacionada con la presencia de genes expandidos de estas enzimas en el genoma del animal y su alta expresión en la glándula digestiva. También se encuentran amilasas y maltasas en estos lugares, que aseguran la digestión de glucógeno y almidón de las plantas, algas y animales de la dieta. Además, se resalta la diversidad de proteasas (Fig.4), especialmente metaloproteasas y serina peptidasas, que se encuentran en las glándulas salivales y digestivas. También se observan metaloproteasas exclusivas en el saco del estilo, lo que sugiere la participación de las bolsas ventrolaterales esofágicas y/o glándulas unicelulares en el tracto digestivo. Interesantemente, hemos descubierto una proteasa de 30 kDa de distribución ubicua en el tubo digestivo de [Pomacea canaliculata], que es secretada por el simbionte de la glándula digestiva, por tanto, esta enzima emerge como un actor importante para la digestión de proteínas dietarias de su huésped. Como una extensión de estos estudios básicos, y a través de una colaboración entre Australia y Argentina, esta línea de investigación proyecta identificar blancos moleculares para el control invasivo de este molusco.

III. Biomonitoreo ambiental de metales pesados y Uranio

Esta línea estudia metales de importancia para la salud ambiental y humana, incluidos en la lista de sustancias prioritarias de la Agencia para el Registro de Sustancias Tóxicas y Enfermedades debido a sus frecuencias de aparición en ecosistemas acuáticos, toxicidades y potencial de exposición humana y el medio ambiente. Específicamente hemos propuesto a [Pomacea canaliculata] como modelo animal acuático para el monitoreo ambiental de arsénico (As), mercurio (Hg), cadmio (Cd) y uranio (U) (Fig.5), ya que este animal presenta una extraordinaria capacidad de acumulación de ellos.

Toxicocinética, bioconcentración y memoria de exposición
Estudios de activación neutrónica y espectrometría de absorción atómica electrotérmica han evidenciado la excepcional capacidad de la glándula digestiva y el riñón de [Pomacea canaliculata] para acumular metales da partir de concentraciones ecológicamente en exposiciones de 96 h, así como a concentraciones permitidas para el consumo humano durante 60 días. (https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2017.12.145; https://doi.org/10.1007/s11356-019-07082-x). Estos tejidos alcanzan factores de bioconcentración de uno o dos órdenes de magnitud por arriba de la concentración del metal en el agua. Un aspecto intrigante es que la glándula digestiva acumula una gran parte de este metal en su bacteria simbiótica intracelular, pero aún desconocemos el mecanismo utilizado por esta bacteria en su nicho intracelular. Asimismo, estos órganos y el simbionte son capaces de retener el metal por al menos 8 semanas, generando una ventana de tiempo lo suficientemente larga para evidenciar emisiones ambientales de los metales de estudio. Un ejemplo interesante de esta aplicación es la dinámica ambiental del arsénico proveniente de cenizas de volcanes activos del sur del país, que ingresa al agua y luego es concentrado por este molusco acuático.

Mecanismos de toxicidad y respuestas tisulares a la exposición
Un factor común a la exposición metálica de P. canaliculata es la generación de radicales libres tisulares, aunque de diferente magnitud, que produce daño oxidativo a macromoléculas, y en paralelo y activa mecanismos celulares de defensa antioxidante (https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1123977). De esta manera, simulamos en el laboratorio escenarios toxicológicos ambientales para comprender los mecanismos fisiológicos de acumulación y respuesta de detoxificación del animal, y eventualmente identificar biomarcadores útiles para monitorear ecosistemas acuáticos naturales. Actualmente, hemos puesto el foco en el conjunto de genes eucariotas y bacterianos que codifican enzimas capaces de transformar arsénico en la glándula digestiva. También, estamos estudiando la expresión de metalotioneínas en el parénquima renal de [P. canaliculata] ya que estas proteínas son excelentes sensores y movilizadores de los metales. Estas respuestas a la injuria metálica se verían favorecidas por la presencia de islotes de hemocitos renales, el principal sistema defensa celular interno del animal, pero esta hipótesis aún no ha sido explorada.

Mecanismos de toxicidad y respuestas tisulares a la exposición
Con la información molecular y celular disponible generamos modelos fisiológicos toxicocinéticos de acumulación y detoxificación elemental. A través de la utilización de un radiotrazador de arsénico (V) de alta actividad específica propusimos el primer modelo toxicocinético (https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.152760) (Fig 6), evidenciando el potencial de este molusco para acumular y retener arsénico en un amplio rango de concentraciones disueltas en el agua (1 a 1000 ug/L).

IV. Los ampuláridos como huéspedes intermediarios de vermes parásitos de interés biomédico

Las enfermedades tropicales causadas por parásitos son un problema sanitario actual que afecta a millones de personas en el mundo. Pomacea canaliculata es huésped intermediario alternativo del nematodo Angiostrongylus cantonensis, el agente etiológico causante de meningoencefalitis eosinofílica, una enfermedad zoonótica emergente en el sudeste asiático e islas del Pacífico, Australia, y más recientemente, reportada en América del Sur y el Caribe. Los ampuláridos actúan también como vectores de parásitos trematodos (Platyhelminthes, Digenea). Se han encontrados esquistosomas en [Pomacea paludosa], que producen dermatitis cercarial en los seres humanos. Pomacea glauca es un huésped intermediario natural de Echinochasmus zubedakhaname. Cercaria udoi y Cercaria paraudoi han sido reportadas en Pomacea glauca y Marisa cornuarietis. Además, se han encontrado diferentes estadios larvarios de Echinostoma parcespinosum y Dietiziella egregia en Pomacea canaliculata.

Nuestro grupo ha combinado un enfoque morfológico y molecular para su identificación de formas larvarias y de especies crípticas en huéspedes intermediarios ya que la taxonomía de los trematodes se basa principalmente en las características morfológicas del estadio adulto en el huésped definitivo. Recientemente, hemos publicado el primer estudio morfológico y molecular de trematodos zoonóticos en ampuláridos neotropicales. Asolene platae mostró en los espacios hemocélicos y tejido conectivo de su glándula digestiva una alta prevalencia de equinocercarias y xiphidiocercarias. Las posiciones filogenéticas de estos trematodos (inferidas por los genes rRNA 28S, ITS1 y mtCOXI) mostraron a las secuencias equinocercariales fuertemente asociadas al polifilético género Echinochasmus (Echinochasmidae), mientras que las secuencias xifidiocercariales se asociaron al género Phaneropsolus (Phaneropsolidae). Ambos géneros, Echinochasmus y Phaneropsolus causan enfermedades gastrointestinales en los humanos, particularmente a través del consumo de caracoles y pescado crudo. Recientemente, describirnos los estadios larvales del trematodo Stomylotrema vicarium (Stomylotrematidae, Xiphidiata) dentro de la glándula digestiva de una especie de Pomacea endémica de la selva de Misiones (Fig.7.C.), completando luego de 100 años el ciclo de vida completo de este parásito.

V. Vigilancia epidemiológica en aguas residuales en la provincia de Mendoza, Argentina

Este proyecto se enmarca en el concepto de “Una Salud” y la utilización del monitoreo de aguas residuales para obtener información temporal y espacial de la población mendocina respecto a diferentes grupos de patógenos (Fig.8). El cribado de aguas residuales constituye una herramienta de vigilancia en salud pública y es conocida como Epidemiología Basada en Aguas Residuales (EBAR). Actualmente, nuestro grupo de trabajo ha propuesto un estudio observacional, descriptivo, de carácter exploratorio de muestras de aguas residuales de las dos plantas de tratamiento, Campo Espejo y El Paramillo, que recibe influentes de aproximadamente el 60% de la población mendocina. Este estudio está dirigido a dos grupos de patógenos, SARS-CoV-2 y enterobacterias resistentes a antibióticos. En el primer caso, predecimos que, a pesar del alcance de la vacunación en nuestra población, EBAR permitirá la detección precoz de nuevas variantes de SARS-CoV-2. En el segundo caso, predecimos que las aguas residuales constituyen una ruta importante para la diseminación (y potencial adquisición) de enterobacterias resistentes a antibióticos betalactámicos y carbapenémicos, cuestión relevante epidemiológicamente por la reutilización de este recurso en cultivos estacionales en plantaciones aledañas a la planta de tratamiento de efluentes. Más recientemente, junto al Ministerio de Salud de la provincia de Mendoza, estamos trabajando en la puesta a punto para el aislamiento y caracterización del virus de la hepatitis A. Esta propuesta es de naturaleza interinstitucional y multidisciplinaria que activamente busca sumar profesionales.